Sesión 5. Marco teórico

I.             INTRODUCCIÓN 

1.1  El género Mycobacterium 

1.1.1 Taxonomía

De acuerdo al Manual Bergey de Bacteriología Sistemática, volumen V, el género Mycobacterium se clasifica dentro del Phylum Actinobacteria, Clase Actinobacteria, Orden Corynebacteriales, Familia Mycobacteriaceae (URL 1).

El género Mycobacterium es el único perteneciente a esta familia y se encuentra comprendido por más de 140 especies ampliamente distribuidas en la naturaleza como especies saprófitas y otras como especies patógenas, tal es el caso de Mycobacterium tuberculosis, M. leprae y M. ulcerans, agentes causales de tuberculosis (TB), lepra y úlcera de Buruli, respectivamente (Cosma, Sherman, & Ramakrishnan, 2003; Forrellad, y otros, 2013).

1.1.2 Características generales

Este género se encuentra conformado por bacilos aerobios, inmóviles y no esporulados, cuyo tamaño oscila entre 0.2-0.6µm X 1-10µm y que bajo ciertas condiciones pueden formar filamentos ramificados que se rompen con facilidad adquiriendo una forma bacilar (Hartmans, de Bont, & Stackebrandt, 2006). Estas bacterias poseen una peculiar estructura de la pared celular, que las provee de una barrera fuertemente impermeable a fármacos y otros componentes nocivos, como los desinfectantes; además de jugar un papel fundamental en la virulencia del bacilo (Delogu, Sali, & Fadda, 2013; Forrellad, y otros, 2013).

Gracias a las nuevas técnicas de microscopía, se ha podido observar que las micobacterias poseen una membrana lipídica asimétrica compuesta por ácidos grasos de cadena muy larga, llamados ácidos micólicos, y en cuyo lado externo se encuentran presentes glicolípidos y componentes cerosos, como el 6,6’-dimicolil trehalosa (TDM) o factor cordón. La membrana exterior y la interior forman un espacio periplásmico en donde se localiza una fina capa de peptidoglicana unida covalentemente a la arabinogalactana y a la lipoarabinomanana que, a su vez, se unen a los ácidos grasos (Delogu, Sali, & Fadda, 2013). Esta estructura impide la decoloración de las micobacterias por soluciones ácidas, por lo que también son conocidas como bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) (Hartmans, de Bont, & Stackebrandt, 2006; Forrellad, y otros, 2013).

Las micobacterias se clasifican de acuerdo a su velocidad de crecimiento en dos grandes grupos, de esta forma encontramos aquellas micobacterias de crecimiento rápido, como M. smegmatis, generalmente consideradas oportunistas o no patógenas; y a las micobacterias de crecimiento lento, dentro de las cuales encontramos a las especies del Complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT) (Hartmans, de Bont, & Stackebrandt, 2006; Forrellad, y otros, 2013).

1.2  Complejo Mycobacterium tuberculosis

El Complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT) se encuentra conformado por un conjunto de especies estrechamente relacionadas y que comparten más del 99.9% de identidad a nivel de los nucleótidos del rRNA 16S; sin embargo, difieren en algunas características, entre las cuales destaca su capacidad para causar enfermedad en distintos hospederos (Cosma, Sherman, & Ramakrishnan, 2003; Ernst, Trevejo-Nuñez, & Banaiee, 2007; Forrellad, y otros, 2013).

Las especies que en la actualidad conforman este complejo son: M. tuberculosis, M. africanum,        M. bovis, M. canettii, M. microti, M. caprae, M. pinnipedii (Ernst, Trevejo-Nuñez, & Banaiee, 2007; Forrellad, y otros, 2013), M. mungi (Alexander, y otros, 2010), M. orygis (van Ingen, y otros, 2012) y M. suricattae                   (Parsons, Drewe, van Pittius, Warren, & van Helden, 2013); todas estas especies de micobacterias causan TB en diferentes hospederos; sin embargo, únicamente algunas de ellas afectan al ser humano, siendo esta enfermedad altamente infecciosa y de distribución mundial.

1.3  Epidemiología

A poco más de 20 años de que la Organización Mundial de la Salud (OMS) declarara a la TB como una emergencia mundial de Salud Pública, hoy en día esta enfermedad continúa siendo un problema sanitario a nivel global (URL 2).

De acuerdo al informe anual (2014) de la OMS, se estima que durante el año 2013 se presentaron 9 millones de casos nuevos de TB a nivel mundial, de los cuales, 1.5 millones de personas murieron debido a esta causa. Este reporte también señala que el 13% de los casos totales de TB (1.1 millones de casos) corresponden a pacientes seropositivos para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH positivos), de los cuales, a su vez, 360 000 murieron (WHO, 2014).

La incidencia anual de la TB en los países desarrollados no sobrepasa los 10 casos por cada 100 000 habitantes, tal como sucede en Australia, Canadá, Estados Unidos y algunos países de Europa Occidental. Mientras que la incidencia aumenta hasta más de 500 casos por cada 100 000 habitantes en algunos estados africanos y del Sureste Asiático. En México, la OMS estima una incidencia de 20 a 49 casos por cada 100 000 habitantes (WHO, 2014); mientras que la Dirección General de Epidemiología registró en 2014 una incidencia de 13.56 casos de TB por cada 100 000 habitantes, mostrando una disminución respecto al año 2011, en el que se reportó una incidencia de 14.15    (URL 3).

1.4  Patogenia

La TB pulmonar es una enfermedad contagiosa que se transmite de persona a persona cuando un individuo, que cursa con la enfermedad activa, emite aerosoles con la tos característica de la enfermedad. Las pequeñas gotas que conforman estos aerosoles albergan bacilos infecciosos que pueden ser inhalados por un individuo sano (Delogu, Sali, & Fadda, 2013; Chapman & Lauzardo, 2014).

Después de que las micobacterias son inhaladas, estas llegan al espacio alveolar del nuevo hospedero, en donde son rápidamente fagocitadas por los macrófagos (MØ) alveolares y las células dendríticas (DCs). De manera inmediata, diferentes mecanismos de la respuesta inmune innata son activados, entre ellos la generación de las especies reactivas del nitrógeno (NOS) y del oxígeno (ROS) (Zuñiga, y otros, 2012).

La eficacia de los mecanismos microbicidas de la respuesta inmune innata dependen de la capacidad intrínseca de los MØ alveolares, de las características patogénicas de la cepa de M. tuberculosis y del microambiente inflamatorio en el sitio de la primo-infección, lo que puede derivar en distintos cursos clínicos, tal como se muestra en la Figura 1 (Zuñiga, y otros, 2012).

Si la bacteria es capaz de sobrevivir a la primera línea de defensa, esta comienza a replicarse activamente en los MØ y las DCs; de esta manera, el bacilo puede diseminarse a células cercanas, incluyendo células epiteliales y endoteliales, logrando en pocas semanas alcanzar una elevada carga bacteriana (Delogu, Sali, & Fadda, 2013).

El microambiente inflamatorio generado por la proliferación de la micobacteria induce el reclutamiento de otras células periféricas como monocitos, neutrófilos, linfocitos y DCs al sitio de la infección. Además las DCs se activan por receptores tipo Toll (TLR) y los monocitos se diferencian a MØ, los cuales producen sustancias microbicidas, incluyendo TNF-α y otras citocinas, que contribuyen a la contención del bacilo en el granuloma (Zuñiga, y otros, 2012; Delogu, Sali, & Fadda, 2013).

Figura 1. Cursos clínicos de la TB.  La infección por este microorganismo se lleva a cabo por vía aérea, pudiendo seguir distintos cursos clínicos de acuerdo al estado inmunológico del hospedero. (a) Eliminación de la micobacteria. (b) Enfermedad activa, también conocida como TB primaria. (c) Fallo de la respuesta inmune innata, induciendo el reclutamiento de otras células inflamatorias que controlan la infección con la formación del granuloma. (d) Reactivación que tiene como resultado la manifestación de la enfermedad activa (TB secundaria) y la diseminación del bacilo a otros órganos (TB extrapulmonar) (Kaufmann, 2004).

El granuloma es una estructura organizada que se forma como respuesta ante la inflamación pulmonar, resultado de la interacción entre las células de la respuesta inmune del hospedero y los antígenos micobacterianos producidos por el bacilo. El granuloma está conformado por diversas células como: fibroblastos, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, linfocitos T, linfocitos B y linfocitos tipo “natural killer” (NK) (Gideon & Flynn, 2011).

Una de las funciones del granuloma es la de proveer un ambiente inmunológico en el que las células del hospedero interactúan para inhibir la proliferación del bacilo y prevenir la diseminación a otras regiones del pulmón o a otros órganos. Sin embargo, también otorga un nicho en el que el bacilo puede persistir durante un largo periodo; lo que se ve acompañado por cambios en el metabolismo bacteriano (Gideon & Flynn, 2011; Druszczynska, Kowalewicz-Kulbat, Fol, Wlodarczyk, & Rudnicka, 2012).

Dentro del granuloma, la micobacteria se encuentra sometida a múltiples condiciones de estrés como la hipoxia, la deficiencia de nutrientes, un pH ácido y la inhibición respiratoria por acción de los NOS; todas estas condiciones inducen la expresión de genes que conducen al bacilo a una fase de persistencia que caracteriza a la infección latente (Druszczynska, Kowalewicz-Kulbat, Fol, Wlodarczyk, & Rudnicka, 2012).

1.5  Latencia y reactivación de M. tuberculosis

El término infección latente ha sido ampliamente utilizado para describir a aquellos individuos infectados por M. tuberculosis que no presentan ningún síntoma de TB pulmonar o extra pulmonar. A diferencia de los pacientes que cursan con la enfermedad activa, estos individuos no son contagiosos y poseen radiografías pulmonares sin anormalidades o signos de la enfermedad (Druszczynska, Kowalewicz-Kulbat, Fol, Wlodarczyk, & Rudnicka, 2012; Chapman & Lauzardo, 2014).

De acuerdo a los datos emitidos por la OMS, una tercera parte de la población mundial (2 mil millones de personas) se encuentra infectada de manera latente con M. tuberculosis; lo que constituye una fuente constante para la reactivación y la diseminación de la enfermedad. En la actualidad existe una probabilidad del 5% al 10% de que las personas infectadas desarrollen la TB activa a lo largo de su vida, lo que representa una población de 200 millones de personas en riesgo; además, la probabilidad de reactivación se ve incrementada en personas inmunocomprometidas, tal es el caso de los pacientes con VIH, desnutrición y diabetes (URL 2).

En las últimas décadas se han desarrollado modelos animales e in vitro que pretenden establecer la relación existente entre las condiciones de hipoxia dentro del granuloma y la inducción de la latencia. Uno de los modelos in vitro más estudiados y que ha permitido obtener un ambiente con poca disponibilidad de oxígeno, lo que induce la latencia en este microorganismo; es el modelo establecido por Wayne y Hayes (1996) (Rustad, Sherrid, Minch, & Sherman, 2009).

Este modelo consiste en un cultivo líquido que se encuentra herméticamente sellado incubado a 37°C con agitación controlada, lo que permite la disminución paulatina del oxígeno disponible dentro del sistema. De esta manera, es posible obtener bacilos en un estado de persistencia no replicativa (NRP) y que resisten a los efectos microbicidas de la anaerobiosis (Wayne & Hayes, 1996).

Bajo el modelo de hipoxia de Wayne y Hayes existe un cambio evidente entre el crecimiento activo y el estado de NRP, donde pueden observarse dos fases importantes. La fase 1 o NRP1, se caracteriza por el incremento lento de la densidad óptica del cultivo debido a las condiciones de microaerofília generadas (concentración de oxígeno del 1%). Cuando se alcanzan las condiciones de anaerobiosis (concentración de oxígeno del 0.06%) el crecimiento celular se detiene, alcanzando la fase conocida como NRP2 (Wayne & Hayes, 1996). Los bacilos tuberculosos pueden permanecer bajo estas condiciones un largo periodo y bajo un nuevo ambiente rico en O₂ reanudar su crecimiento saliendo del estado de latencia inducido por hipoxia (Meza-Segura, 2010).

Por otra parte, se ha observado que la tuberculosis latente puede reactivarse años o décadas después de la primo infección, lo que ha sugerido que la latencia es un proceso dinámico entre el sistema inmune del hospedero y la replicación bacteriana (Gideon & Flynn, 2011). Los modelos experimentales en primates no humanos han permitido observar que durante la infección latente, la micobacteria se encuentra metabólicamente activa y que se replica en los tejidos del hospedero a pesar de la ausencia de signos y síntomas de la enfermedad (Delogu, Sali, & Fadda, 2013).

Todavía no se han logrado comprender en su totalidad todos los aspectos que permiten el paso de la enfermedad latente a su forma activa; sin embargo, algunos autores sostienen que durante la latencia la mayor parte de los bacilos se encuentran sin dividirse, mientras que una menor parte de los bacilos se encuentran en estado replicativo activo (las dos poblaciones se encuentran en equilibrio dinámico). A estos bacilos se les ha dado el nombre de “scouts”, mismos que son constantemente procesados y eliminados por el sistema inmune del hospedero; por lo que se ha sugerido que son los responsables de la inducción de células T efectoras y de memoria dirigidas contra diversos antígenos de la micobacteria. Cuando la inmunidad del hospedero falla en el control de los “scouts”, estos se comienzan a replicar a mayor velocidad y envían señales que permiten que la mayoría de las bacterias se reactiven (Gengenbacher & Kaufmann, 2012; Delogu, Sali, & Fadda, 2013).  Un ejemplo de estas señales son las proteínas similares al “factor promotor de la reactivación (Rpf)” de Micrococcus luteus y que son codificadas por una familia de cinco genes (rpfA, rpfB, rpfC, rpfD y rpfE) encontrados dentro del genoma de M. tuberculosis; sin embargo, la naturaleza bioquímica y el mecanismo por el cual actúan otras señales debes ser investigadas con mayor profundidad (Fattorini, Piccaro, Mustazzolu, & Giannoni, 2013; Bozzano, Marras, & De María, 2014).

1.6  Mecanismos moleculares de persistencia intracelular y reactivación de la enfermedad

Una vez que M. tuberculosis ha sido fagocitada por los MØ, esta se ve sometida a una gran cantidad de mecanismos antimicrobianos que tienen como finalidad la degradación del patógeno. Sin embargo, esta micobacteria ha logrado desarrollar la capacidad de adaptarse, propagarse y persistir intracelularmente mediante una amplia variedad de estrategias como la inhibición de la maduración del fagosoma, la respuesta ante la producción de ROS y NOS y la inhibición de la muerte celular (Kaufmann, 2004; Forrellad, y otros, 2013).

Por otra parte, se han descrito diversos antígenos inmunodominantes que son expresados por M. tuberculosis durante las primeras fases de la infección; tal es el caso de Fbp (proteína de unión a fibronectina) o, también llamado, antígeno 85 (Ag85). Este antígeno es un complejo de tres proteínas (FbpA, FbpB y FbpC2) que se encuentran codificadas por los genes fbpA, fbpB y fbpC2, respectivamente. Se sabe que este complejo juega un papel muy importante en la patogénesis de este microorganismo, al promover la adhesión de la micobacteria a la mucosa, facilitando la entrada a las células del hospedero (Forrellad, y otros, 2013).

Los sistemas de secreción son muy importantes en la adaptación y supervivencia de un microorganismo en el medio ambiente, además de permitir la interacción con las células del hospedero mediante la exportación de antígenos como en el caso del sistema de secreción ESX-1 de M. tuberculosis, en donde participan ESAT6 (codificado por el gen esxA) y CFP10 o ESXB; dos proteínas pequeñas que han sido descritas como antígenos inmunodominantes durante la infección (Forrellad, y otros, 2013).

Otro de los aspectos que se ha estudiado respecto a la latencia de M. tuberulosis, es el papel que juegan los lípidos; en este sentido se ha sugerido que M. tuberculosis es capaz de utilizar los lípidos propios del hospedero (incluido el colesterol) como fuente de energía durante la infección latente permitiéndole persistir intracelularmente en el hospedero. Se sabe que esta micobacteria tiene la facultad de acumular gotas de lípidos intracelularmente, tal como se ha observado en los bacilos tuberculosos aislados del esputo de pacientes que cursan con la infección activa (Rodríguez-Peredo, 2011; Forrellad, y otros, 2013; Yong-Mendoza, 2015).

Actualmente se cuenta con suficiente evidencia experimental que permite sugerir que la capacidad de M. tuberculosis para producir la infección latente se encuentra estrechamente relacionada con la adquisición de colesterol proveniente del hospedero. En 2008, Pandey y Sassetti emplearon una cepa mutante de esta micobacteria en el operón mce4 (M. tuberculosis Δmce4), involucrado en el transporte del colesterol, y observaron que la multiplicación intracelular del bacilo mutante era deficiente en comparación con la cepa silvestre.  Se ha demostrado que este esterol es degradado por la micobacteria, empleando el núcleo esteroideo para la producción de energía y la cadena alifática lateral para la biosíntesis de  componentes de la pared celular, como el factor de virulencia PDIM (“phthiocerol dimycocerosate”) (Pandey & Sassetti, 2008; Ouellet, Johnston, & Ortiz de Montellano, 2011). Además, la secuenciación del genoma de M. tuberculosis ha expuesto una serie de genes potencialmente implicados en el metabolismo lipídico, tal es el caso de los genes igr y kstR, ambos fuertemente relacionados con la regulación del catabolismo del colesterol y con la infección y persistencia intracelular del bacilo (Kendall, y otros, 2010; Ouellet, Johnston, & Ortiz de Montellano, 2011).

Se sabe que dentro del operón igr se encuentran codificadas dos acil coenzima A deshidrogenasas (fadE28/29), el citocromo P450 (cyp125) involucrado en la síntesis de PDIM, entre otras proteínas participantes en el metabolismo del colesterol. Algunos autores, han demostrado que la falta de este operón impide el crecimiento de M. tuberculosis en presencia de colesterol debido a la acumulación de intermediarios tóxicos generados durante las primeras etapas de la degradación de este esterol (Forrellad, y otros, 2013).

Como se mencionó con anterioridad, la reactivación de M. tuberculosis se encuentra mediada por una serie de señales que, a la fecha, no se les ha logrado determinar su naturaleza bioquímica o esclarecer su mecanismo de acción; sin embargo, a partir del descubrimiento de la familia de genes rpf se han realizado múltiples ensayos que pretenden esclarecer el papel que desempeñan las cinco proteínas Rpf en el crecimiento y reactivación de M. tuberculosis. De esta manera, se realizó un estudio con mutantes deficientes en alguno de estos genes para infectar ratones C57BL/6 y, así, poder evaluar el crecimiento bacteriano y la inmunopatología después de 16 semanas; los resultados mostraron que las cepas mutantes son fenotípicamente similares a la cepa silvestre, lo que sugiere que la función de las proteínas Rpf son total o parcialmente redundantes ya que la pérdida de uno de los genes puede ser compensada por la expresión de uno o más de los homólogos restantes (Gupta & Srivastava, 2012).

Otros estudios se han centrado en la cuantificación de la expresión de los genes rpf durante diferentes etapas de crecimiento y condiciones de estrés fisiológico, lo que ha proporcionado evidencias que sugieren que los genes de esta familia realizan funciones distintas durante el crecimiento y la supervivencia cuando el bacilo se ve sometido a distintas condiciones de estrés fisiológico; así, por ejemplo, se encontró que ante la hipoxia se sobre expresan los genes rpfC y rpfE,  lo que también ha sugerido que los cinco genes son regulados diferencialmente (Gupta & Srivastava, 2012). Además, se logró demostrar la participación de la familia de genes rpf en la reactivación del bacilo al construir mutantes carentes de tres de estos genes en diferentes combinaciones que se mostraron incapaces de reactivarse en el modelo murino (Gupta & Srivastava, 2012).

A pesar de los estudios que han demostrado que las proteínas Rpf juegan un papel muy importante en la reactivación del bacilo tuberculoso, el mecanismo por el cual promueven y regulan este proceso continúa siendo poco claro. Se ha sugerido que estas proteínas tienen la capacidad de modificar la pared celular al presentar actividad similar a la lisozima tipo C. Además, se ha podido demostrar la presencia de proteínas (como RipA) que interaccionan con RpfB y RpfE para formar complejos capaces de hidrolizar la peptidoglicana e interaccionar con el septo celular, por lo que se ha sugerido que estos complejos pueden estar participando en la división celular posiblemente durante la reactivación (Gupta & Srivastava, 2012).

1.7  Antecedentes

Las últimas investigaciones sobre M. tuberculosis ponen en evidencia que el bacilo tiene la facultad de metabolizar el colesterol que se encuentra como constituyente en las membranas de las células hospederas, principalmente de MØ alveolares.

En 2011, Rodríguez-Peredo analizó la expresión de 17 genes diferentes implicados en el metabolismo de lípidos, la respuesta oxidativa, la hipoxia, la secreción de antígenos y el ciclo celular cuando esta micobacteria se encuentra en latencia inducida por hipoxia, y empleando al colesterol como única fuente de carbono. Del análisis de expresión, se encontró que durante las fases NRP1 y NRP2 existió una sobre-expresión de los genes fbpB y esxA, que se encuentran involucrados en la producción de antígenos inmunodominantes. Se ha propuesto que la sobre-expresión de estos genes durante la latencia de M. tuberculosis, en presencia de colesterol, podría estar involucrada en la sobrevivencia del bacilo y por lo tanto en su persistencia intracelular. También se encontraron sobre-expresados los genes fadD21 y tgs1, relacionados con la degradación de lípidos y síntesis de lípidos de reserva, respectivamente; esto sugiere que durante la latencia la micobacteria utiliza al colesterol como fuente de carbono para la síntesis de lípidos de reserva (Rodríguez-Peredo, 2011).

Como se mencionó con anterioridad, en la actualidad no ha sido posible esclarecer los mecanismos por los cuales M. tuberculosis es capaz de reactivarse del estado de latencia, por lo que, en los últimos años algunos estudios se han centrado en el establecimiento de distintos modelos de reactivación in vitro y en MØ humanos. De esta manera, Meza-Segura y Rivera-Morales estandarizaron un modelo de reactivación in vitro de M. tuberculosis, mediante el cual, lograron relacionar a los genes hspX, dosR y rpfB con el proceso de reactivación (Meza-Segura, 2010; Rivera-Morales, 2012).

En 2012, Iona y colaboradores estudiaron la reactivación de M. tuberculosis en fase NRP2 (en presencia de glucosa) mediante un modelo de reactivación en MØ humanos. En este trabajo se realizó la cuantificación de la expresión de varios genes bacterianos durante la infección, encontrando una baja expresión de esxA durante la infección con la fase NRP2, lo que confirmó la hipótesis de que los bacilos provenientes de esta fase se mantuvieron en latencia intracelularmente (al menos hasta el día 4 post-infección). También se analizó la expresión genética de los MØ THP-1 encontrando que los bacilos en latencia (NRP2) inducían la expresión de los genes  codificantes para cox-2 y PGE2; en estudios previos se ha reportado su rol protector ante la necrosis de los MØ, dirigiendo a las células a una vía pro-apoptótica (Iona, y otros, 2012). En este modelo de reactivación las micobacterias se cosecharon por centrifugación y se resuspendieron en medio RMPI para poder ajustar las suspensiones bacterianas a las multiplicidades de infección (MOI) empleadas; además, estas suspensiones se almacenaron en congelación para su uso posterior, con lo cual se involucraron factores externos que pudieran alterar el estado metabólico del bacilo antes de tener contacto con las células.

Posteriormente, Yong-Mendoza estandarizó un modelo de reactivación de M. tuberculosis en macrófagos humanos en el que fue posible establecer el papel que juegan el colesterol y otros lípidos de reserva durante la infección y la persistencia intracelular del bacilo. En este modelo se propusieron algunas mejoras respecto al publicado por Iona y colaboradores en 2012; entre las de mayor relevancia está la propuesta de reactivar al bacilo directamente en las células, sin que se le someta a un proceso de centrifugación y congelación previa; además la de utilizar al colesterol durante la adaptación de M. tuberculosis a la latencia in vitro ya que se sugiere que juega un papel importante en la persistencia de la micobacteria. En este trabajo se logró determinar que los MØ THP-1 poseen la misma capacidad para fagocitar bacilos provenientes de las fases Log y NRP2, independientemente de la fuente de carbono, tal como fue reportado por Iona y colaboradores en 2012; también se observó que M. tuberculosis adaptada a un ambiente con colesterol persiste de manera intracelular en los macrófagos THP-1 durante mayor tiempo y ocasionando menor daño a la monocapa en comparación con los bacilos adaptados a ambientes con glucosa. Por otra parte, este estudio mostró que la eficiencia en la infección temprana de los macrófagos THP-1 es menor con los bacilos provenientes de la fase NRP1 en comparación con la infección con la fase Log o con la fase NRP2, mientras que con esta última, se observó  que el bacilo tiene una menor capacidad para diseminarse a otros MØ THP-1 (Yong-Mendoza, 2015).